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公司新闻/正文
【敲黑板】注意！细胞转染效率低下的六大坑！
478 人阅读发布时间：2023-10-13 13:29
【细胞转染】
细胞转染是分子生物学和细胞生物学中常用的实验技术手段。但实验友友们经常遇到的问题就是转染效率低下，尤其是针对原代细胞转染，难度更大，令人谈"转染"色变。细胞转染的过程和方法，protocol教科书和实验手册上面都有。这里，小编根据自己做细胞转染近10年的经验和体会，总结出了导致转染效率低下的六大坑，以及避免掉坑的做法，大家来围观吧！
1.准备不足
针对脂质体介导的细胞转染，在进行正式实验前要多做几次预试验，进而优化转染条件。优化内容包括：细胞密度、脂质体用量、DNA密度、脂质体和DNA混合孵育时间等等。
2.电压过大
采用电转方法时，若电压太大，会导致细胞大量死亡，不同的细胞，需要的电压不同。需要多做预实验，多摸索条件。针对大多数细胞，最佳电压是250-1250v/cm。选择处于对数生长期的细胞进行转染，细胞浓度在5x106到1x107／mL之间。每次转染的质粒应控制在4-6 μg，如果>10 μg，转染效率也会大大降低。电击后，将DNA和细胞混合液在室温下放置10分钟，以便细胞恢复损伤。
3.质粒问题
转染用的质粒要保证数量和质量，一般要高于2 μg以上。如果质粒纯度不够或含有对细胞有毒害的物质，会影响转染效率。一旦遇到这种情况，要及时对质粒进行纯化和浓缩。
4.细胞状态不好
第二条中已提到进行转染的细胞应处于对数生长期。如果是贴壁细胞的话，贴壁率应该在70-80%；如果是悬浮细胞的话，应该是6X105个/孔（24孔板），在转染前一天换液，转染前用无血清培养基或PBS洗细胞一次。转染的整个过程都不应该有抗生素。
5.细胞污染
细胞污染会造成细胞死亡，同时使转染效率低下。转染细胞用的质粒必须保证无菌，但是现在市场上一般的质粒提取试剂盒都做不到绝对无菌。
除菌绝招：在质粒提取的最后一步，用75％乙醇沉淀，这样就除菌了。
6.不注意细节
在转染之前更换一次37℃预温的培养基，可提高转染效率。脂质体和DNA/RNA混合物应当一滴一滴地滴下来，从培养皿一边滴到另一边，边滴边轻摇培养皿，以确保均匀分布和避免局部高浓度。这些都是一些细枝末节，但是，如果不注意的话，也会造成转染效率低下。
细胞转染是分子生物学和细胞生物学中常用的实验技术手段。但实验友友们经常遇到的问题就是转染效率低下，尤其是针对原代细胞转染，难度更大，令人谈"转染"色变。细胞转染的过程和方法，protocol教科书和实验手册上面都有。这里，小编根据自己做细胞转染近10年的经验和体会，总结出了导致转染效率低下的六大坑，以及避免掉坑的做法，大家来围观吧！
1.准备不足
针对脂质体介导的细胞转染，在进行正式实验前要多做几次预试验，进而优化转染条件。优化内容包括：细胞密度、脂质体用量、DNA密度、脂质体和DNA混合孵育时间等等。
2.电压过大
采用电转方法时，若电压太大，会导致细胞大量死亡，不同的细胞，需要的电压不同。需要多做预实验，多摸索条件。针对大多数细胞，最佳电压是250-1250v/cm。选择处于对数生长期的细胞进行转染，细胞浓度在5x106到1x107／mL之间。每次转染的质粒应控制在4-6 μg，如果>10 μg，转染效率也会大大降低。电击后，将DNA和细胞混合液在室温下放置10分钟，以便细胞恢复损伤。
3.质粒问题
转染用的质粒要保证数量和质量，一般要高于2 μg以上。如果质粒纯度不够或含有对细胞有毒害的物质，会影响转染效率。一旦遇到这种情况，要及时对质粒进行纯化和浓缩。
4.细胞状态不好
第二条中已提到进行转染的细胞应处于对数生长期。如果是贴壁细胞的话，贴壁率应该在70-80%；如果是悬浮细胞的话，应该是6X105个/孔（24孔板），在转染前一天换液，转染前用无血清培养基或PBS洗细胞一次。转染的整个过程都不应该有抗生素。
5.细胞污染
细胞污染会造成细胞死亡，同时使转染效率低下。转染细胞用的质粒必须保证无菌，但是现在市场上一般的质粒提取试剂盒都做不到绝对无菌。
除菌绝招：在质粒提取的最后一步，用75％乙醇沉淀，这样就除菌了。
6.不注意细节
在转染之前更换一次37℃预温的培养基，可提高转染效率。脂质体和DNA/RNA混合物应当一滴一滴地滴下来，从培养皿一边滴到另一边，边滴边轻摇培养皿，以确保均匀分布和避免局部高浓度。这些都是一些细枝末节，但是，如果不注意的话，也会造成转染效率低下。